Inmunología
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Coordinador: José Peña Martínez

Fases del proceso de cito toxicidad mediada por células del sistema inmune   El sistema inmune efector está formado por células inmunocompetentes que están especializadas en reconocer y destruir otras células consideradas como extrañas  y microorganismos patógenos. De esta manera el sistema inmune nos defiende de células infectadas por virus, células que han perdido los caracteres de identidad propia, células tumorales o microorganismos patógenos que nos invaden. Entre las células que poseen esta función lítica/destructora (citotóxcia) destacan:  

Linfocitos T citotóxicos (CTL ).

Células asesinas naturales (NK).

Macrófagos y neutrófilos.

Lisis por linfocitos T citotóxicos 

Los linfocitos T citotóxicos (CTL) poseen una gran eficacia citolítica. La lisis se inicia  con el reconocimiento  y adhesión de la célula diana a lisar. Prosigue con la activación celular conducente a la preparación de las estructuras líticas y el  proceso destructor (citolítico) propiamente dicho, en el que se producen una serie de cambios en las células blanco  que conllevan su destrucción  (Figura: Fases citotoxicidad).

Reconocimiento de CTLs

El proceso de reconocimiento y adherencia entre las  CTLs y las células blanco es sustancial. En primer lugar, es necesaria la unión del complejo TCR/CD3  dela CTL con sus ligandos HLA clase I y el péptido correspondiente en la célula diana. Además, se requiere la presencia de moléculas  CD28 y sus ligandos CD80, que proporcionarán el coestímulo necesario  para el inicio de la transducción de señales.  Moléculas de adhesión, tales como el LFA-1 y su ligando, se encargan de estabilizar el contacto intercelular al unirse a sus ligandos en la superficie de la célula diana. Tambien es necesario un incremento del número de receptores de citocinas, especialmente de la IL-2 que propiciará el apoyo necesario para la proliferación celular (Figura: Lisis CTL/NK).

Diferentes formas de reconocimiento en el proceso citotóxicoActivación de CTLs 

Posteriormente a las interacciones celulares  indicadas,  se produce la activación de las células CTLs que se hacen evidentes en múltiples  modificaciones aparecidas en ellas. Entre éstas destacan:

1. La reorganización del citoesqueleto, con localización del centro organizador de microtúbulos (MTOC) y de los centriolos próximos a la zona de contacto intercelular. 

2. La polarización del aparato de Golgi y de los gránulos de secreción en la misma zona.

3. Fusión de los gránulos con la membrana plasmática, que permitirá la posterior exocitosis de su contenido al espacio intercelular.

4. La secreción de ciertas citocinas, particularmente IFN-gamma y TNF-alfa que son importantes mediadores de la citotoxicidad. 

5. Facilitación de la expresión de la molécula Fas ligando (FasL) en las células efectoras. Esto permitirá que después sea posible su unión con las moléculas Fas presentes en las células diana, lo que posibilita el desarrollo del proceso lítico que estudiaremos a continuación.

Fase lítica de CTLs

En esta fase trataremos  los fenómenos líticos utilizados por las ceúlas CTL, que  en su esencia son los mismos que los que utilizan las células NK. Esta acción es compleja, tanto para células T como para las NK y requiere un estricto control, puesto que un error en ello podría conducir a la destrucción de las propias células del organismo, lo que sería  indeseable y caótico.  En este proceso destaca la liberación de factores lítico/citotóxicos, tales como perforina y granzimas, de los gránulos donde se encuentran almacenados.

los linfociotos T estimulan mediante linfocinas a las células CTL incrementanso así su capacidad citolítica.La consecuencia de este proceso es la muerte de la célula blanco, por un mecanismo que implica daño de la membrana celular con aparición de poros y el subsiguiente desequilibrio electrolítico. A este proceso se le ha venido denominando muerte celular por necrosis. (Figura: Necrosis y apoptosis).

En  el inicio de este proceso lítico interviene, ademas de las moléculas TCR y sus ligandos (HLA + Ag) y la pareja B7 y CD28,  el  ligando FAS (FASL)   muy abundante en  la membrana de las células efectoras después de su activación. Este ligando interactúa con las moléculas FAS de la célula blanco,iniciando una vía lítica de gran importancia.

Finalmente, el proceso conduce a la muerte celular por un mecanismo conocido como apoptosis, que se caracteriza por la ruptura  del DNA de las células blanco en múltiples fragmentos. 

 Acción de la perforina y granzima

Tanto las moléculas de perforina como de granzima, se encuentran almacenadas en gránulos de donde serán liberados cuando se desarrollen los procesos proteolíticos. Los gránulos son estructuras con un núcleo electrodenso y poseen pH ácido. Cuando se produce la activación de las células efectoras (CT o NK), estos gránulos salen del linfocito y vierten en la membrana de la célula diana su contenido, tanto de granzima como de perforina.

Mediadores de la fase lítica de linfocitos. Intervienen prioritariamente TNF, IFN y granzimasLa perforina actúa produciendo poros en la membrana de la célula blanco, similar a lo que ocurre como consecuencia de la acción del sistema del complemento a través del complejo de ataque a la membrana (MAC). Estos poros posibilitan la entrada en la célula blanco de la granzima y de otros muchos componentes moleculares. Este fenómeno puede medirse in vitro por la liberación del isótopo 51Cr, con el que previamente se marcan las células diana en el laboratorio, para estudiar estos procesos.

Como Granzima, se conocen ciertos componentes, todos ellos con actividad serina esterasa, que se encuentran específicamente en los gránulos de los linfocitos citotóxicos. Como perforina o proteína formadora de poros (PFP) se conocen unas moléculas que se localizan en los gránulos, y que presentan la propiedad de interaccionar con fosfolípidos de la membrana plasmática. Cuando se produce (como consecuencia de la activación celular) la liberación del contenido de los gránulos de los linfocitos citotóxicos sobre  la membrana plasmática de la célula diana, la perforina entra en contacto con el calcio intercelular y polimeriza.

La polimerización de varias subunidades de perforina forma estructuras tubulares, identificables por microscopía electrónica, que constituyen canales y aumentan la permeabilidad de  la membrana plasmática. Estos poros formados por la perforina hacen que la célula diana sea incapaz de regular los la concentración iónica, produciendo un desequilibrio osmótico que conduce a su lisis.

Por estos poros penetra también la granzima en las células diana, ejerciendo así su efecto citotóxico. También en este proceso citolítico intervienen el TNF α y β y el IFN-γ. (Figura: Citotoxicidad CTL)

El reconocimiento y activación celular es diferente según se trate de muerte celular por apoptosis o necrosis aunque generalmente van unidos ambos procesosAcción del  Fas y FasL

Desde los estudios de Russell se sabe que en las células diana, en el proceso de lisis celular, se produce una degradación del ADN en múltiples fragmentos antes, incluso, de que ocurra la permeabilización de la membrana plasmática.

En función de estos datos se propuso que en el proceso citotóxico se produce la activación de endonucleasas de la propia célula diana, por un mecanismo denominado apoptosis

Este proceso de apoptosis consta de dos fases:

  1-Una fase primera en la que la célula se programa para morir, activándose las enzimas proteolíticas encargadas del proceso, denominadas caspasas. La proteína transmembrana, Fas, una vez se ha unido su ligando FasL, interactúa con un factor intermedio denominado FADD (factor associated death domain) activando el complejo cisteinil-aspartato proteasas (caspasas). De igual manera interviene el TNF, que al interactuar con el TNFR-1, participa también activando las caspasas. Se han descrito 11 caspasas en células humanas que provocan una degradación proteica bien definida hasta llegar a los cuerpos apoptóticos. Algunas caspasas son "iniciadoras" y otras son "efectoras" del proceso catalítico, actuando sobre otras proteínas directamente responsables de la fragmentación del ADN, las endonucleasas. Mientras el  Fas no está unido a su ligando, esta vía permanece inactiva.

 FADD, dominio de muerte asociada  a Fas. Principales eventos del proceso de apoptosis inducido por linfocitos citotóxicos2-La puesta en marcha de la vía de las caspasas culmina con el fraccionamiento del DNA y muerte celular en un proceso que se denomina muerte por apoptosis (Figura: Apoptosis por CTL). En el núcleo se degrada el ADN y se hacen visibles condensaciones de cromatina nuclear, formándose aglomeraciones que se desplazan hacia la superficie de la membrana nuclear. La muerte celular se produce después de grandes alteraciones nucleares, de la membrana plasmática y de las mitocondrias.

Una vez han muerto las células, éstas sonreconocidas como células seriamente deterioradas, siendo fagocitadas por los macrófagos que actúan como células limpiadoras del organismo, reconociendolas de manera inespecífica.

Fase lítica de NK

Efectivamente, la lisis mediada por las células NK puede ser de dos formas en cuanto al sistema de reconocimiento utilizado. Una, es aquella en la que la célula blanco es reconocida de manera indirecta por receptores Fc y de complemento, que a su vez son las estructuras que identifican la célula blanco. La otra forma, es por reconocimiento no directo en el que participan receptores especializados que pueden ser de tipo activador o inhibidor.

Fagocitosis en la que se observa como la partícula fagocitada es envuelta por el macrófagoAunque las células NK no expresan receptores de célula T específicos de antígeno (TCR), sí poseen otro tipo de receptores no específicos de HLA. Las células NK utilizan diversos receptores para reconocer a las células blanco, tal y como hemos visto en el capítulo dedicado a las células NK. Entre estos receptores destacan los FcR (CD16) presentes en su membrana celular, que reconocen la fracción constante (Fc) de las inmunoglobulinas y ciertos receptores de activación o inhibición. Estos receptores son específicos de las células NK y tienen como ligando moléculas de histocompatibilidad clase I a las cuales se unen pero de manera inespecífica.

En cualquier caso, el reconocimiento de las células blanco por las células NK, no está restringido por las moléculas HLA. Por otra parte, también es de destacar que a diferencia de las CTL, las células NK no guardan recuerdo de acontecimientos anteriores y por tanto no se generan células memoria de tipo NK. Sin embargo, las células NK destruyen células tumorales e infectadas por virus mediante procesos similares a los que ejercen los linfocitos T citotóxicos.

Receptores “scavenger” descritos en la cubierta de macrófagosLas células NK poseen múltiples gránulos que incluyen perforina y granzimas y, además, poseen FasL en su superficie, con lo que inducen con facilidad la muerte  de células blanco que poseen Fas. A diferencia de los CTL, que requieren activarse antes de la aparición de gránulos, las células NK siempre tienen gránulos en su citoplasma aunque éstos poseen mayor actividad cuando estas células son activadas con IL-2, en cuyo caso se les denomina células activada por IL-2 (LAK).

Lisis por células NKT

A pesar de que las células NKT expresan TCR, éste no reconoce péptidos, sino que reconoce glucolípidos presentados por las moléculas CD1, son unas moléculas de histocompatibilidad no clásica. Estas células expresan ciertos marcadores propios de NK, entre ellos el conocido como CD161. En definitiva, estas células, aunque se encuentran en muy bajas cantidades en el organismo, parece ser que poseen una  maquinaria citolítica  muy eficiente.

  Lisis por monocitos y macrófagos

Los macrófagos poseen capacidad de destruir microorganismos y células extrañas o propias alteradas. Intervienen especialmente como parte de la respuesta inmune innata y también colaboran en el inicio de la respuesta inmune adaptativa presentando péptidos y produciendo citocinas relevantes.

Modelo de un receptor perteneciente a la familia tipo Toll Para desarrollar sus efectos líticos, los macrófagos poseen receptores especializados en el reconocimiento de microorganismos y células, y una maquinaria especializada en su destrucción. Además poseen receptores de citocinas, entre los que destacan el receptor de IFN-gamma.

A continuación, veremos cómo se llevan a cabo los procesos de reconocimiento, activación  y lisis mediados por los macrófagos y qué comparten con los neutrófilos en sus aspectos esenciales (Figura: Fagocitosis).

Proceso de reconocimiento por macrófagos

Los macrófagos y neutrófilos reconocen las sustancias extrañas, principalmente  microorganismos, mediante una gran variedad  de receptores.  Entre estos receptores destaca un grupo de receptores iniciadores de la fagocitosis (RIF) que se caracterizan  por reconcer  el extremo Fc de las Igs (FcR ó CD16) o ciertos componentes derivados de la activación del complemento (CRs). Además estas célualas poseen un grupo de receptores, conocidos como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs),   que se caracterizan  por identificar un alto número de moléculas  presentes, todas ellas, en la mayoría de los patógenos pero no en los tejidos propios del individuo.  A continuación, veremos  algunos aspectos específicos de estos receptores.

La activación de los receptores TOLL induce una activación de NF-kB que actuando sobre el ADN induce la formación y expresión de nuevas moléculas B7 y activación de Th0 mediante la liberación de IL-12Receptores iniciadores de la opsonización y fagocitosis.

De los receptores  Fc (FcR) destacan los  FcRI y FcRIII que se caracterizan por reconocer con alta afinidad el extremo Fc de las inmunoglobulinas. Entre  los receptores del complemento  (CR) destacan CR1, CR2, CR3 y CR4, que se caracterizan por reconocer los fragmentos activados derivados  de la degradación del complemento, C3 (C3b) y sus productos de escisión proteolíticos, C3b1, C3d y C3dg rspectivamente.

Receptores de PAMPs

Estos receptores no están sometidos a los procesos de reordenamiento de segmentos génicos como ocurre con las inmunoglobulinas y el TCR. De esta manera, todos los macrófagos exhiben los mismos receptores, todos con capacidad  de reconocer los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en la mayoría de los microorganismos.

La activación de macrófagos induce  la aparición de aumento de moléculas en su superficie, tales como HLA-II, TNFR  y B7  y la producción de factores citotóxicosEsto permite a todos y cada uno de los macrófagos, tener la posibilidad de reconocer de manera universal a los microorganismos,  lo que representa un mecanismo muy eficiente y rápido de defensa. Sin embargo, los macrófagos carecen de memoria inmunológica y no pueden mejorar su respuesta tras un segundo contacto con el mismo patógeno. Entre estos receptores destacan: receptores tipo TOLL, receptores depuradores o “scavenger" y receptores lectina tipo C.

Receptores tipo Toll.

Similares a los  Toll-like receptor (TLRs), se encuentran en monocitos, neutrófilos y células dendríticas y por reconocer las estructurasPAMPs, poseen la capacidad de unirse a una gran variedad  de microroganismos (Figura: Activación Toll).

Se han identificado hasta el momento diez tipos,  que se diferencian por reconocer diferentes  estructuras dentro de PAMPS (Tabla: Receptores tipo toll en mamíferos).

Receptores depuradores. De las estructuras PAMPs que reconocen destacanan los lipopolisacaridos y ciertos polirribonucleótidos presentes en una gran variabilidad de bacterias  (Figura: Receptores depuradores).

Receptores de lectina tipo C. Estos receptores se caracterizan por el reconocimiento de hidratos de carbono presentes en la superficie de la  gran mayoría de microorganismos. Específicamente reconocen residuos de manosa, galactosa y otros. 

Activación de macrófagos

Todos los receptores de los macrófagos anteriormente  estudiados se unen a sus ligandos, iniciándose    el proceso de fosforilación de la cola citoplasmática de muchos de ellos con lo que se activa la cascada de segundos mensajeros en los macrófagos.

Metabolismo de la lisis bacteriana dependiente de oxígeno. Se observa la síntesis de radicales activos de oxígeno a partir del proceso glucolíticoPor ejemplo, en el caso de los receptores tipo Toll,  se producirá la activación predominante de NF-kB, que como se sabe actúa sobre los  genes controladores de la síntesis de IL-1, IL-12 y TNF, receptores de citocinas, moléculas de histocompatibilidad y la mayoría de los elementos que participan en la lisis de microorganismos patógenos. (Figura: Activación macrófagos).

Cabe  destacar que este proceso de activación suele presentarse en los focos inflamatorios formando parte de la respuesta innata y que además sirve de estímulo para el inicio de la respuesta adaptativa, al ser los macrófagos unos excelentes presentadores de antígenos a los linfocitos T.

Proceso lítico de macrófagos

Una vez que los receptores presentes en macrófagos y neutrófilos  reconocen a los patógenos, se inicia   un proceso de activación del macrófago que conduce a la interiorización   de los  microorganismos mediante un proceso conocido como  fagocitosis  (Figura: Lisis macrófagos).

La fagocitosis se inicia cuando, después de unirse los macrófagos a los microorganismos, en la membana de los macrófagos se produce la polarización de actina de la zona subyacente al sitio de contacto, lo que conduce a la aparición de pseudópodos que envuelven al microorganismo y lo introducen en el interior celular formando una vacuola o fagosoma. Posteriormente, los microrganismos serán destruidos, para lo cual los fagosomas se fusionarán con los lisosomas presentes en el interior celular y se formarán los fagolisosomas,  donde los componentes líticos de los lisosomas son vertidos sobre los microorganismos  para su destrucción. 

Mediadores de lisis en macrófagos

En el proceso de destrucción de las sutancias extrañas, por ejemplo patógenos, en los fagosomas de los macrófagos y también de los neutrófilos, intervienen dos sistemas de distinta naturaleza. Uno, mediado por sustancias dependientes de la producción de  derivados del oxígeno, son los intermediarios reactivos de oxígeno (IRO) y el otro,  mediado  por susantancias  independientes del oxígeno, como son ciertas enzimas y componentes con actividad bactericida.

Mediadores dependientes de Oxígeno.

Los mediadores dependientes de oxígeno  se inician por la enzima NADPH oxidasa  presente en la membrana de los fagosomas, que actuando sobre el  oxígeno lo transforma en anión superóxido, (O2-) . Éste puede dar lugar a la formación de peróxido de hidrógeno, anión hipoclorito y radicales hidroxilo.  Estos productos que se forman como consecuencia de la explosión respiratoria iniciada poseen todos ellos una gran capacidad tóxica. Así el propio anión superóxido y el H2O2son agentes con gran poder bactericida, proceso en el que  está implicada la mieloperoxidasa, enzima que en presencia de iones haluro convierte el  H2O2 en ácido hipohalúrico. Como el cloruro es el haluro más abundante en los sistemas biológicos, se produce ácido hipoclóroso, que es un agente bactericida muy potente (Figura: Explosión respiratoria).

El H2O2 se puede reducir, dando lugar al  radical hidroxilo (OH-) que es altamente tóxico. En el caso de que por ejemplo el H2O2 salga fuera del fagosoma, puede causar daño celular de importancia si no es destruido por una enzima citoplasmática llamada glutatión peroxidasa. 

Distintas familias de receptores que aparecen una vez activados los macrófagos Las mutaciones en cualquiera de los genes que codifican a los componentes de NADPH oxidasa dan origen a una patología conocida como enfermedad granulomatosa crónica (ver figura niño),  caracterizada por la incapacidad de los fagocitos para producir anión superóxido. Ello se asocia con infecciones bacterianas y micóticas recurrentes, que pueden causar la muerte del paciente si no se instaura a tiempo el tratamiento adecuado

Mediadores independientes de oxígeno.

Además de los mediadores dependientes de oxígeno antes indicados, los macrófagos producen intermediarios reactivos del nitrógeno. Entre ellos destaca el óxido nítrico (NO) formado por  la intervención de la enzima sintetasa inducible de óxido nítrico (NOSi) que se activa  como respuesta a productos bacterianos, principalmente  cuando actúa el IFN-gamma. En el interior de los fagosomas el óxido nítrico puede combinarse con el peróxido de hidrógeno  o con superóxidos generando peroxidonítritos que poseen una gran capacidad destructiva de microorganismos patógenos.

Además de estos mediadores, tanto de macrófagos como de neutrófilos, se pueden producir y secretar también TNF-alfa e incluso ciertas metaloproteinasas y lisozimas, todos ellos de gran capacidad lítica.

En resumen, son numerosos y muy variados los mecanismos microbicidas utilizados por macrófagos y por neutrófilos.  Básicamente, tras contactar los microorganismos  con  los macrófagos o  con neutrófilos, son reconocidos por los sus  receptores presentes en la membrana, fagocitados y destruidos con la intervención de mediadores dependientes o  independientes del oxígeno.

 Ver Siguiente Capítulo: 11" Regulaciones del sistema inmune"

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