Inmunología
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Coordinador: José Peña Martínez

Muchos de los progresos alcanzados durante los últimos cincuenta años en biología y medicina, han sido posibles gracias al desarrollo de nuevos métodos analíticos basados en las reacciones inmunológicas, conocidos como técnicas de inmnunoanálisis, que permiten el estudio, el reconocimiento y la cuantificación de una gran cantidad de moléculas.

 

Su áreas de aplicación son el diagnóstico clínico, en donde ha permitido una mejora sustancial de diagnostico clínico de multitud de patologías diferentes, como infecciones, enfermedades autoinmunes y un largo etc. Muchas de estas técnicas son también usadas en el laboratorio de biología como herramienta de análisis y estudio, pero que no entran el objetivo de este capítulo.

Las técnicas de inmnunoanálisis, más útiles y prácticas son aquellas que, se basan en la especificidad de la unión de los anticuerpos con antígenos concretos, unión Ac-Ag, de tal manera que si se dispone de un determinado anticuerpo frente a una sustancia definida, por ejemplo una 

Curva de precipitación obtenida mezclando concentraciones crecientes de antígeno con una cantidad constante de anticuerpo. La precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva)

hermana, se puede cuantificar e incluso aislar dicha hormona. Igualmente este principio es aplicado a la medida e incluso separación de poblaciones celulares basado en la característica diferenciales de sus proteínas de superficie que como sabemos difieren de unos tipos celulares a otros. Además se pueden analizar células de un mismo tipo, pero en diferentes estadios de activación, maduración o diferenciación.


Placa de doble difusión de Ouchterlony preparadaen agar. Se hacen visibles las líneas de precipitación que aparecen como consecuencia de la unión de un determinado antígeno con su anticuerpo.Aunque el principio es el mismo, existen muchas modalidades de métodos que difieren, sobre todo, en la formar de visualización de los complejos Ag-AC. Cuando lo que se mide es directamente el precipitado formado por los complejos formados, sehabla de reacciones de precipitacióny si lo que se mide es la aglutinación de células, reacciones de aglutinación. Sin embargo estos procedimientos requieren grandes cantidades de Ag o de Ac para su visualización. Por ello actualmente se acude a métodos que permiten visualizar esos complejos mediante mecanismos indirectos, que son capaces de emitir alguna señal. Entre ellos destacan, el inmunoenzimoensayoque utilizan sustancias que de cambian de color y elInmunofluorescenciapor su propiedad de emitir fluorescencia, quimioluminiscencia, cuando se hacen visible por la emisión de luz o radioinmunoensayo cuando se hacen patentes por la emisión de radioactividad.

A veces se trata de técnicas que utilizan una combinación de varios procedimientos, como es el caso del Western Blott(inmunoblotting) o la inmunocitometría de flujoentre otros. Esto hace que estos métodos de inmnunoanálisis, tengan muchas aplicaciones dependiendo de si lo que se quiere medir son sustancias solubles o fijadas a células o a tejidos, etc.(Tabla 1).

Técnicas de inmunoprecipitación

En estas técnicas las sustancias (antígenas) son analizadas midiendo el precipitado visible de Ac-Ag. Su realización requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac.


Inmunoelectroforesis de suero humano normal (SN) y un suero procedente de un individuo con mioloma IG (SP). Se muestra ne la parte superior (A) la electroforesis de ambos sueros y en la parte inferior la inmunoeletroforesis frente a anti IgG (B) y frente antiinmuno-globulinas totales (C). Existen diferentes modalidades, como son la precipitación en tubo, difusión radial de Ouchterlony, inmunoelectroforesis y difusión radial de Mancini.

Técnica de precipitación en microtubosEl complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción ente Ags y Acs de la mezcla es equivalente. Si a diferentes cantidades de antígenos se le añade igual cantidad de un anti­suero, la precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva). Sin embargo disminuye en donde predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reacción es utilizado sólo en contados casos debido a que requiere grandes concentraciones de antígeno o de anticuerpo para poder medir el precipitado formado (Figura 1).

Técnica de difusión radial doble de OuchterlonySe realiza en placas de agar en donde se practican pocillos En uno de estos pozos se coloca el suero o muestras a investigar y en el resto se coloca el anticuerpo, preparado frente a la sustancia que se quiere identificar. Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarán y se formará en la zona de equivalencia elcomplejo Ag-Ac, que se hace visible en forma de una línea de precipitación si hay un solo antígeno o de varias líneas si hay varios antígenos (Figura 2). Permite identificar bandas de precipitación mediante el empleo simultáneo de Ac y Ag conocidos.

Técnica de Inmunoelectroforesis. Se realiza en dos fases. En la primera se separa la mezcla de Ags por electroforesis y en la segunda se coloca un anticuerpo específico en una ranura lateral. Por difusión llegan a encontrarse los antígenos y el antisuero, apareciendo el complejo Ag-Ac, visible en forma de líneas de precipitación que pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar. Esta técnica sigue siendo de utilidad en la identificación de las proteínas monoclonales de mieloma (Figura 3).


Placa de difusión radial de Mancini. Cuando la concentración del antígeno es la adecuada (zona de equivalencia) los inmunocomplejos ag-ac  se insolubiliza y se forma un anillo de precipitación visisible. Técnica de difusión radial simple de Mancini.
Se basa en la difusión de un antígeno colocado en un pocillo en un gel de agarosa que lleva incorporado un anticuerpo específico. Este anillo de precipitación es fácilmente visible y las concentraciones anti­génicas se relacionan directamente con el área del círculo de precipitación (Figura 4). Al difundir el antígeno se genera un gradiente de concentración desde el pocillo que se ha colocado.

Técnica de nefelometría. Estas técnicas se basan en la detección de los complejos Ag-Ac, llamados nefelómetros por la refracción que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el antígeno y el anticuerpo correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos láser y se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. Este procedimiento es rápido y sensible y es de utilidad en cuantificación de proteínas en suero y en otros líquidos biológicos (Figura 14).

Técnicas de inmunoaglutinación.Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.En estas técnicas sehacen visibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte, o se ha unido artificialmente, a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos (hemaglutinación) o partículas de látex.

Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido (Tabla 2). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación de sus distintos grupos.


Inhibición y aglutinación de glóbulos rojos por gonadotrofina coriónica (HCG) presente en sueroTécnicas de Inmunofluorescencia

Cuando se utiliza como marcador fluoresceínaPara la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo, detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

La fluorescencia es una propiedad de ciertas moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de longitud de onda adecuada, emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su cuantificación. Las moléculas de un colorante fluorescente absorben luz en una longitud de onda y convierten la luz absorbida de alta energía (longitud de onda más corta) en luz de menor energía (longitud de onda más larga).

Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característico; si se utilizan dos con el mismo espectro de excitación pero distinto espectro de emisión, se pueden medir dos características al mismo tiempo (fluorescencia de dos colores). La Inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la proteína que se desea detectar marcados con moléculas fluorescentes (Figura 6).

Se aprecia si hubo unión del anticuerpo con el antígeno por la fluorescencia emitida, que se observa bajo microscopio de luz ultravioleta. Este procedimiento (Inmunofluorescencia directa) tiene la limitación del marcaje con un fluorocromo de cada uno de los anticuerpos necesarios para cada una de las sustancias a investigar. Para evitar esto, lo que se hace es tratar el tejido o células con antisueros anti-antígeno producidos, por ejemplo, en conejo y secundariamente anti-inmunoglobulinas marcadas con un fluorocromo (Inmunofluorescencia indirecta).


Inmunofluorescencia directa con un anticuerpo primario (izquierda) e indirecta con la utilización de un anticuerpo secundario (derecha).Citometría de flujo. 
Es una técnica de inmunofluorescencia que se utiliza para el estudio de poblaciones celulares de sangre periférica y en la que se utiliza un equipo especial, citómetro de flujo, para medir las células marcadas.

Para ellos, la suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser que produce la dispersión de la luz y la activación de la fluorescencia.

Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio de las emisiones fluorescente emitidas por el fluorocromo utilizado (Figura 7). Además de basarse en la detección de la fluorescencia emitida por las células marcadas, también lo hace en otras propiedades diferenciales de las células en estudio, como tamaño (FSC), complejidad (SSC), etc. (Figura 8).

La señal, producida como consecuencia de la excitación del fluorocromo, permite conocer el porcentaje de células reconocido por el anticuerpo monoclonal empleado. Como consecuencia se observan imágenes en dos dimensiones (Dot-Plot), (Figura 9) o en una dimensión (histograma) (Figura 10) en las que se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas.

También con este tipo de equipos, es posible la separación de distintas componentes celulares de una mezcla. Para ello el citómetro lleva acoplado un sistema que carga eléctricamente las células y, con placas deflectoras, se realiza su separación en tubos distintos.

La puesta a punto de las técnicas de citofluorometría, en las que se conjuga además del uso de los anticuerpos monoclonales, los avances de informática y de rayos láser permite el análisis fenotípico y funcional de las células inmunocompetentes y en general de todas aquellas frente a las cuales se disponga de un antisuero que las identifique.

Marcadores de linfocitos B. entre los que destacan el CD19, inmunoglobulinas de membrana y otras moléculas como CD21, CD22 y CD24. Cuando se activan aumenta la expresión de HLA-DR y del receptor de la IL-2.

Marcadores de linfocitos TSe definen por el marcador CD3 presentes en linfocitos T totales, mientras que las células T h y Tc expresan CD4 y Tc CD8 respectivamente. Cuando se activan aparecen nuevas moléculas de superficie, como son receptores de interleucinas (como la molécula CD25 que corresponde a la cadena p55 del receptor de la IL-2), receptores de la insulina y de la transferrina (CD71), antígenos HLA clase II, que están presentes en linfocitos T en reposo y las moléculas CD26, CD29, VLA-2 y CD69.

Citómetro de flujo y separación celular (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorter)

Técnica de radioinmunoensayo.

El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse estacompetición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa (ver esquema anexo).

Imagen en dos dimensiones de citometría de flujo (Dot-Plot). Se detalla como la población de linfocitos  puede analizarse utiliazando dos marcadores (CD8 y CD3) con lo cual se pueden visualizar cuatro subpoblaciones linfocitarias (CD3-,CD+,CD8+ y CD3+CD8+).

Si que quiere cuantificar los niveles de una hormona, los resultados se obtienen midiendo la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la hormona unida al anticuerpo, precipita, al formar agregados, fácilmente precipitables. Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada.

A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentración de la hormona no marcada a investigar.

Además de los usos del radioinmunoensayo se pueden aplicar también en histología, técnicas inmunoradiohistológicas, o en la detección de tumores primarios o metastásicos, inmunoescintografía, e incluso la posibilidad de irradiación de células neoplásicas inmunorradioterapia.

Sin embargo, estas técnicas tiene el inconveniente derivado del uso de isótopos, lo que obliga a disponer de instalaciones acreditadas. Afortunadamente existen otras técnicas como es el inmunoenzimoensayo que es más simple y no requieren de instalaciones complejas para su realización.

Histograma en una dimensión de una de las fluorescencias medidas  en el dot-plot y en donde se distinguen las diferentes poblaciones celulares marcadas con las moléculas CD4, CD3 y CD8.

Técnica de inmunoenzimoensayo

Este procedimiento es conocido universalmente conocida como test de ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). La identificación de complejos Ag-Ac se hace mediante el empleo de enzimas bien unidas al antígeno o bien unidas al anticuerpo. El test ELISA puede ser directo, o no competitivo.  El empleo de un antígeno inmovilizado que se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable por el cambio de color que sufre. Este es el procediendo conocido como inmunoenzimoensayo directo.


Técnica de peroxidasa aplicada a tejidos. El primer anticuerpo tiene actividad frente a los antígenos a estudiar, y el segundo, que va dirigido frente al primero y que actúa de puente con el complejo portador de la enzima. La aparición de diferentes niveles de color, medido mediante espectrofotometría, nos indica la cantidad de muestra presente. Su realización comienza con el tapiza la placa con el anticuerpo específico frente al antígeno a determinar, para después añadir la muestra con el antígeno. Fiablemente se adiciona el anticuerpo secundario marcado con la enzima que, en presencia de su sustrato, da un producto coloreado soluble que después de un tiempo de incubación es cuantificado mediante el lector de ELISA (Figura 11).

Además del test directo, en ocasiones, se utiliza inmunoenzimoensayo indirecto, que se hace con el fin de reducir los costos y se usa un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. Su realización se diferencia del caso anterior en que se añaden los anticuerpos, previamente incubados con la muestra. Los anticuerpos que no se han unido a los antígenos de la muestra lo harán a los antígenos de los pocillos.

Principio básico de la técnica de ELISA indirecto o competitivo. A) Se fija el antígeno a los pocillos. B) Se añade al pocillo la muestra previamente incubada con el anticuerpo primario. C) Adición del anticuerpo secundario marcado con una enzima cuyo producto es coloreado.

Como enzimas se suelen utilizar la peroxidasa, la galactosidasa o la glucosa oxidasa. Esta técnica se utiliza para la medida de hormonas, antígenos de la hepatitis y otras muchas sustancias que se encuentran a muy bajas concentraciones.

Una variante del inmunoenzimoensayo as es cuando el antígeno se encuentra fijo en células o tejidos, donde se emplean dos anticuerpos. Cuando la enzima es la peroxidasa, este complejo suele ser una peroxidasa /antiperoxidasa (PAP), (Figura12 el puede esta imagen esta mal reducir estas dos figura s un

Principio básico de la técnica de ELISA indirecto o competitivo. A) Se fija el antígeno a los pocillos. B) Se añade al pocillo la muestra previamente incubada con el anticuerpo primario. C) Adición del anticuerpo secundario marcado con una enzima cuyo producto es coloreado.

Técnicas de inmunoblotting

Esta técnica se desarrolla en tres fases. En el primero se separaran las sustancias a analizar mediante electroforesis, generalmente de poliacrilamida, En el segado, los componentes ya previamente separados, se transfieren, también por electroforesis, a una membrana generalmente de celulosa. Por último los componentes, en la membrana, se visualizan utilizando anticuerpos marcados con colorantes o isótopos. De este modo se puede determinar la presencia y cantidad de sustancias a pesar de que originariamente estén mezcladas.


Esquema de un nefelómetro. Los complejos Ag-Ac formados son cuantificados por el grado de difracción. Se establece una relación entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados.Una de estas técnicas es el Western blot que combina la resolución de la electroforesis en gel con la especificidad de la detección inmunoquímica. Se utiliza para determinar la presencia y cantidad de antígenos y de anticuerpos específicos.

En la actualidad es el test confirmatorio más empleado para el diagnóstico del SIDA, mediante la identificación anticuerpos específicos frente a las distintas proteínas del VIH en el suero o en la saliva, de una persona supuestamente infectada por el virus VIH. Para su realización se emplean antígenos virales obtenidos por cultivo celular.

Mediante electroforesis se separan las diferentes proteínas víricas por su diferente peso molecular. Posteriormente se transfieren a papel de nitrocelulosa y se incuban con el suero problema que se quiere investigar. Si la persona posee anticuerpos frente a proteínas del VIH, éstos se unirán a todas o a alguna de las bandas desplegadas en el papel de nitrocelulosa. Estos anticuerpos se detectan añadiendo un segundo anticuerpos con actividad anti-IgG humana marcada con una enzima (generalmente peroxidasa) que produce una banda coloreada al añadir un sustrato.

Fundamento de la separación celular empleando la técnica de Dynabeads. Mediante el imán extraemos las células unidas a las dynabeads, que son las células a estudiar.

Una variante de esta técnica es la de Southern Blot, consiste en la separación de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestión con enzimas de restricción. La separación se hace mediante electroforesis y después este DNA es transferido a membranas de nylon o nitrocelulosa (blot). Después, para la identificación de la banda que interesa se realiza un proceso llamado hibridación, en el que la membrana es "incubada" con un fragmento de DNA complementario al gen de interés (sonda) previamente marcada, generalmente con un isótopo, lo que permite posteriormente visualizar mediante autoradiografía la banda en la cual se ha producido la unión (Figura 16).

La técnica de Southern Blot consiste en la separación de fragmentos de DNA previamente obtenidos por digestión con enzimas de restricción

Técnicas de quimioluminiscencia

Hay otros modos para detectar el complejo Ag-Ac, una vez que éste se ha formado. Uno de ellos es la quimioluminiscencia, la cual está tomando cada vez mayor auge. Cuando se utilizan sustancia productoras de luz al ser estimuladas. También están tomando cada vez mayor auge las técnicas quimioluminiscentes. La quimioluminiscenciaconsiste en términos generales en la producción química de la luz. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaces de emitir luz cuando, al absorber la energía de una reacción química oxidativa, son colocadas en un estado de excitación electrónica. La emisión de luz se produce al volver a su estado inicial y la energía química absorbida se cede en forma de fotones fácilmente cuantificables con un fotodetector.

Los marcadores quimioluminiscentes, como es la biotinas, constituyen una alternativa al uso de isótopos radiactivos en el inmnunoanálisis, pues los compuestos quimioluminiscentes son de gran estabilidad y la emisión de luz sólo se produce cuando se provoca la reacción oxidativa siendo posible almacenar largo tiempo los compuestos luminiscentes. Las técnicas anteriores así como las de Inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis e enzimoinmunoensayo pueden realizarse utilizando un sistema de ampliación de las señales empleando el complejo avidina-biotina.

La biotina es una vitamina de bajo peso molecular, y la avidina es una glicoproteína, contenida en la clara del huevo. La biotina se une covalentemente al anticuerpo a través de un grupo amina, carboxilo sulfhidrilo o tiosil. Varias moléculas de biotina, pueden unirse a una de anticuerpo y dada la afinidad biotina-avidina resulta que, cada molécula proteica, se vería unida, a través de la biotina, con varias moléculas de avidina a su vez unidas al marcador correspondiente.

 Selección de células unidas a anticuerpos

En la actualidad disponemos de varios métodos para seleccionar células a las que previamente se ha unido un anticuerpo.

La forma más clásica consistía en añadir complemento a una población celular que previamente ha sido marcada con anticuerpos. En este caso el complemento elimina la población.

También se puede realizar una separación inmunomagnética que se basa en la interacción entre antígenos celulares superficiales y anticuerpos unidos a bolas magnéticas. La aplicación de un campo magnético permite separar las células unidas a las bolas (selección positiva) de las células no unidas (selección negativa).

Es un método fácil, rápido y no muy costoso que  posee múltiples aplicaciones no sólo en Inmunología, sino también en Microbiología, utilizando bolas unidas a anticuerpos frente a un determinado microorganismo; en Biología Molecular para aislamiento de DNA y mRNA, utilizando bolas a las que se adsorbe el DNA y bolas unidas a una secuencia de oligonucleótidos respectivamente.

También se pueden usar para la purificación de proteínas si se unen las bolas a anticuerpos específicos. La separación de células puede realizarse mediante el FACS (Fluorescence activated cell sorting) en la que, además de los dispositivos de citometría ya mencionados, se dispone de mecanismos de separación celular en función de la fluorescencia emitida por las células marcadas con anticuerpos, tal como se indicó en el apartado de citometría de flujo.

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